Analisis Pemisahan Menggunakan HPLC

I.         PENDAHULUAN

Tetrasiklin (TC), termasuk terutama Oxytetracycline, tetrasiklin dan chlortetracycline, adalah antibiotik spektrum luas banyak digunakan dalam mengobati infeksi penyakit pada manusia dan hewan, dan digunakan sebagai promotor pertumbuhan peternakan modern. Penggunaan dari tetrasiklin diterapkan pada hewan adalah 1.469.400 kg di Amerika Serikat pada tahun 1999, 16.268 kg di Inggris pada tahun 2000 dan 3324 kg di Kenya pada tahun 1999. Antibiotik  ini banyak digunakan dalam makanan penghasil hewan untuk pengobatan penyakit dan sebagai suplemen diet. Mereka dapat diberikan secara oral sebagai aditif makanan atau langsung melalui suntikan. Penggunaan antibiotik dapat menyebabkan residu obat dalam daging, terutama jika mereka tidak digunakan sesuai dengan petunjuk label. Kehadiran residu antibiotik pada daging, susu, dll dapat menyebabkan reaksi alergi pada individu yang sensitive.

TC juga telah dilaporkan untuk diproduksi Strain dari Streptomyces aureofaciens, Streptomyces avellanus, Streptomycs feofaciens, Streptomyces alboflavus dan banyak lainnya.  Di antara kelompok TC antibiotik, OTC adalah yang paling banyak digunakan dalam terapi. Hal ini biasanya digunakan untuk pencegahan dan pengobatan penyakit dalam produksi ternak. Sebagai pakan aditif dalam dosis terapi sub, memberikan kontribusi untuk pemeliharaan kesehatan yang optimal dan dengan demikian mendorong pertumbuhan di foodproducing hewan metode yang berbeda. digunakan untuk deteksi dan kuantifikasi dari menyeret antibiotik dan sebagai residu dalam susu dan sampel daging. Kromatografi cair telah menjadi teknik pemisahan yang paling banyak digunakan untuk menentukan antibiotik tetrasiklin dalam produk hewani yang dapat dimakan.

Metode yang digunakan untuk menentukan tingkat residu OTC meliputi mikrobiologi spektrometri massa  dan HPLC. Baru-baru ini perkembangan di teknik kromatografi untuk penentuan residu antibiotik dalam susu telah ditinjau.

II.       METODE

ü  Kimia dan reagen:

Oxytetracycline (99% kemurnian) ,Biomedicals, Metanol, asetonitril, orto asam fosfat, Asam trikloroasetat dan dietil-amin dari HPLC.  Fosfat Monopotassium dan asam sitrat, Extra murni,  Air deionisasi dan Pelarut. HPLC (Hitachi D-2000 sistem manajer Elite) dilengkapi dengan dua pompa L-2130, autoinjector / autosampler L-2200 dan UV-VIS detektor L-2420.

ü  Kondisi kromatografi

 Pemisahan kromatografi dicapai dengan menggunakan oven Kolom L-2300 dan Kolom Intersil ODS-3 C18 (GL Sciences Inc Tokyo Jepang 5μm, 250 × 4,6 mm). Perakitan filtrasi (Model Rocker-300 Thaiwan) dan pembersih ultrasonic Ceia (Model CP-104 Italia) digunakan untuk pelarut filtrasi dan degassing.

ü  Metode Validasi:

Metode parameter validasi yang diteliti adalah batas deteksi (LOQ), batas kuantifikasi (LOD), linearitas, pengulangan dan akurasi. The LOQ didefinisikan sebagai konsentrasi terendah yang dapat ditentukan dengan akurasi yang dapat diterima dan presisi. LOD ditentukan dengan mengencerkan solusi konsentrasi diketahui sampai respon itu tiga kali suara sementara LOQ didefinisikan sebagai konsentrasi terendah yang bias ditentukan dengan akurasi yang dapat diterima dan presisi. The LOQ dihitung atas dasar nilai yang berlaku minimal S / N 10. Linearitas yang ditentukan dengan kurva kalibrasi. Untuk pembangunan kurva kalibrasi, enam kalibrasi larutan standar disiapkan dan setiap larutan standar adalah disuntikkan sekali. Pengulangan diperkirakan dengan pengujian enam mereplikasi sampel pada hari-1 dan hari-2. Akurasi dievaluasi dengan pemulihan tekad.

ü  Persiapan Solusi

Pelarut Persiapan:

(Asam ortofosfat + Triethylamine). 100 ml 1M ortofosfat asam dilarutkan dalam air suling dan 1000ml dan PH itu menyesuaikan diri 3,0 ± 0,1 dengan Triethylamine. (Monopotassium Fosfat + asam sitrat) 500 ml 0,075 M monopotassium Fosfat baik dicampur dengan 500 ml 1,0 M asam sitrat. Metanol dan asetonitril digunakan secara langsung. Semua pelarut disaring melalui filter membran 0.45μm dan degass selama 20 menit dengan pembersih ultrasonik.

Persiapan standar:

Sebuah larutan stok standar OTC (100mg/100mL) dibuat dengan melarutkan obat dalam metanol 40 ml dan Buffer 60ml. Konsentrasi standar adalah solusi 1mg/ml selanjutnya diencerkan dengan fase gerak dalam yang sama rasio 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 dan 5.0μg/ml. Semua solusi yang disimpan pada suhu 4 ° C dan dibawa ke suhu kamar sebelum digunakan.

Preparasi sampel:

Larutan sampel dibuat dengan menambahkan 200 uL lima larutan standar OTC (1.0, 2.0, 3.0, 5.0 dan 10.0 mg / mL) untuk memisahkan 2,0 mL bagian dari sampel susu, diikuti oleh pencampuran menyeluruh. Fortifikasi ini biasanya dibuat oleh spiking. Fortifikasi dengan jumlah yang dikenal analit yang menjadi 0,1, 0,2, 0,3, 0,5 dan 1.0μg/mL masing-masing. Sampel ini diperkaya diizinkan untuk berdiri pada suhu 4 ° C selama 24 jam setelah penambahan OTC. Untuk ekstraksi susu berduri standar yang dikenakan prosedur kimia deprotenizing menggunakan Trichlroaceticacid. Sebuah kecerdasan 2ml sampel susu ditempatkan dalam Tabung reaksi 10 ml dan dikocok secara intensif dengan 3ml dari 20% (v / v) TCA untuk 1 min. Campuran disentrifugasi selama 15 menit pada 5000rpm dan supernatant diinjeksikan ke sistem HPLC 10ul.

Optimalisasi Tahap HP:

 Komposisi fase mobile dioptimalkan berdasarkan metode CHP. Fase berair yang terdiri dari Buffer (asam ortofosfat + Trietilamina) dan (monopotassium Fosfat + asam sitrat) sedangkan organic fase dipilih dari metanol, asetonitril dan Campuran mereka dalam proporsi yang berbeda. Banyak upaya dilakukan pada penyesuaian rasio komponen fase gerak. Pemisahan terbaik dan pemulihan dibuat dengan menggunakan 40% metanol dengan 60% penyangga. (Asam ortofosfat + Triethylamine).

Kromatografi:

Fase gerak dioptimalkan adalah metanol dan Buffer. Pompa A telah disesuaikan pada laju alir 40% untuk Methanol sementara pompa B pada laju alir 60% untuk Buffer. Laju aliran yang ditetapkan sebesar 1 ml / menit. Volume injeksi adalah untuk 10μL sampel dan standar, yang disuntikkan ke kolom oleh autosampler. Itu Pemisahan dicapai dengan menggunakan oven Kolom L-2300 pada suhu 40oC dan kolom Intersil ODS-3 C18 (GL Sciences Inc Tokyo Jepang 5um, 250 × 4,6 mm) dan panjang gelombang deteksi yang ditetapkan sebesar 240 nm. UV absorbansi Efluen dipindai oleh UV Spektrofotometer (optima S-3000 Kyoto, Jepang) selama rentang 200-400nm dan diperoleh dengan mengukur penyerapan solusi 0.1μg/ml, dibuat dari larutan stok. Ini menunjukkan sebuah absorbansi maksimum pada 240nm.

III.     HASIL

ü  LOD dan LOQ:

Batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) assay Metode ditentukan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa batas deteksi obat yang diuji adalah 0,05 mg / ml.  Untuk pengukuran, pertimbangan itu diberikan hanya bila kondisi pertama puas untuk memastikan kehadiran  dari senyawa target yaitu OTC dengan sinyal / noise rasio 3 (S / N = 3).  LOQ dihitung adalah 0.1μg/ml. Jadi, LOQ dimulai dari konsentrasi ini. LOQ dihitung atas dasar minimal yang diterima nilai S / N = 10.

ü  Linearitas:

Intra-hari dan antar-hari presisi ditentukan dengan menyuntikkan 10μl enam standar solusi. (n = 6). Mean dari luas puncak tercatat hari antar dan intra hari diambil untuk kurva kalibrasi. Daerah puncak yang otomatis diukur dengan integrator HPLC instrumen. Kalibrasi kurva diperoleh dengan memplot daerah puncak terhadap konsentrasi standar dan sampel  yang menunjukkan linearitas dalam sesuai dengan hukum Beer selama rentang ini dan persamaan linearitas adalah y = 2121063x - 24.934,9 untuk standar dan y = 195431x -2134,7 untuk sampel. Koefisien regresi r2 berada di kisaran 0,9993-0,9995 (n = 6).

ü  Pemulihan dan ketepatan Streptomisin.

Metode saat ini adalah valid dan akurat. Akurasi dievaluasi oleh penentuan pemulihan. Hasil penelitian kami menunjukkan jumlah yang diperoleh ini metode adalah antara 94% dan 99%. pemulihan mutlak streptomisin sulfat ditentukan dalam rangkap tiga dengan perbandingan langsung luas puncak standar bentuk dibandingkan sampel. Data dianalisis statistik dengan menghitung rata-rata berarti RSD dengan menggunakan rumus. [RSD = (S.D. / Berarti dari pemulihan) × 100%].

 ü  Kekhususan:

Kekhasan metode ini dipastikan dengan menganalisis obat standar dan sampel. Waktu retensi (RT) streptomisin dikonfirmasi dengan membandingkan RT dengan yang standar, yang dalam 1,67-1,70 menit. Kehadiran bahan lain dalam formulasi tidak menyebabkan setiap antarmuka dengan puncak OTC begitu spesifik untuk analisis Oxytetracycline.

IV.     KESIMPULAN

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode HPLC selektif dan sensitive untuk deteksi cepat OTC. Berbagai metode tersedia untuk penentuan tetapi memiliki beberapa kelemahan yang memakan waktu dengan miskin pemulihan dan reproduktifitas. Sedangkan metode yang diusulkan ditemukan cepat, akurat, berulang dan konsisten. Itu berhasil diterapkan untuk analisis obat dalam formulasi dipasarkan dan dapat secara efektif digunakan untuk deteksi dan kuantifikasi residu OTC di Susu, Daging dan Madu. Ini adalah cepat dari metode sebelumnya dilaporkan.